අණුක රෝග විනිශ්චය, බහුලව භාවිතා වන PCR තාක්ෂණය සහ මූලධර්මය

PCR, යනු බහු අවයවික දාම ප්‍රතික්‍රියාව වන අතර එය DNA පොලිමරේස් උත්ප්‍රේරණය යටතේ පද්ධතියට dNTP, Mg2+, දිගු කිරීමේ සාධක සහ විස්තාරණ වැඩි දියුණු කිරීමේ සාධක එකතු කිරීම සඳහා යොමු කරයි, මව් DNA අච්චුවක් ලෙස සහ විශේෂිත ප්‍රයිමර් දිගුවේ ආරම්භක ලක්ෂ්‍යය ලෙස භාවිතා කරයි. denaturation, annealing, extension යනාදී පියවරයන් හරහා, මව් තන්තු අච්චු DNA වලට අනුපූරක වන දියණිය ස්ට්‍රෑන්ඩ් DNA අනුපූරකයේ in vitro ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමේ ක්‍රියාවලිය මගින් vitro තුළ ඕනෑම ඉලක්කගත DNA ඉක්මනින් සහ නිශ්චිතව විස්තාරණය කළ හැක.

1. Hot Start PCR

සාම්ප්‍රදායික PCR හි විස්තාරණය කිරීමේ ආරම්භක වේලාව PCR යන්ත්‍රය PCR යන්ත්‍රයට දැමීම නොවේ, පසුව වැඩසටහන විස්තාරණය කිරීමට පටන් ගනී.පද්ධති වින්‍යාසය සම්පූර්ණ වූ විට, විස්තාරණය ආරම්භ වේ, එය විශේෂිත නොවන විස්තාරණයක් ඇති කළ හැකි අතර, උණුසුම්-ආරම්භක PCR මෙම ගැටළුව විසඳා ගත හැකිය.

උණුසුම් ආරම්භක PCR යනු කුමක්ද?ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතිය සකස් කිරීමෙන් පසුව, ප්‍රතික්‍රියාවේ ආරම්භක උනුසුම් අවධියේදී හෝ “උණුසුම් ආරම්භය” අවධියේදී එන්සයිම විකරණකාරකය ඉහළ උෂ්ණත්වයකදී (සාමාන්‍යයෙන් 90 ° C ට වඩා වැඩි) මුදා හරිනු ලැබේ, එවිට DNA පොලිමරේස් සක්‍රීය වේ.නිශ්චිත සක්රිය කාලය සහ උෂ්ණත්වය DNA පොලිමරේස් සහ උණුසුම්-ආරම්භක විකරණකාරකයේ ස්වභාවය මත රඳා පවතී.මෙම ක්‍රමය ප්‍රධාන වශයෙන් DNA පොලිමරේස් වල ක්‍රියාකාරිත්වය නිෂේධනය කිරීම සඳහා ප්‍රතිදේහ, බන්ධන ලිගන්ඩ් හෝ රසායනික විකරණකාරක වැනි විකරණකාරක භාවිතා කරයි.කාමර උෂ්ණත්වයේ දී DNA පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරිත්වය අඩාල වන බැවින්, PCR ප්‍රතික්‍රියා වල විශේෂත්වය කැප නොකර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී බහු PCR ප්‍රතික්‍රියා පද්ධති සකස් කිරීම සඳහා උණුසුම් ආරම්භක තාක්ෂණය විශාල පහසුවක් සපයයි.

2. RT-PCR

RT-PCR (ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීමේ PCR) යනු mRNA සිට cDNA වෙත ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම සහ එය විස්තාරණය සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කිරීම සඳහා වූ පර්යේෂණාත්මක තාක්‍ෂණයකි.පර්යේෂණාත්මක ක්‍රියා පටිපාටිය වන්නේ පටක හෝ සෛලවල සම්පූර්ණ RNA නිස්සාරණය කිරීම, Oligo (dT) ප්‍රාථමිකයක් ලෙස භාවිතා කිරීම, cDNA සංස්ලේෂණය කිරීම සඳහා ප්‍රතිලෝම ට්‍රාන්ස්ක්‍රිප්ටේස් භාවිතා කිරීම සහ ඉලක්කගත ජානය ලබා ගැනීමට හෝ ජාන ප්‍රකාශනය හඳුනා ගැනීමට PCR විස්තාරණය සඳහා අච්චුවක් ලෙස cDNA භාවිතා කිරීමයි.

3. ප්රතිදීප්ත ප්රමාණාත්මක PCR

ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR (තත්‍ය කාලීන ප්‍රමාණාත්මක PCR,RT-qPCR) යනු PCR ප්‍රතික්‍රියා පද්ධතියට ප්‍රතිදීප්ත කාණ්ඩ එකතු කිරීමේ ක්‍රමයට යොමු කරයි, ප්‍රතිදීප්ත සංඥා සමුච්චය කිරීම භාවිතයෙන් සම්පූර්ණ PCR ක්‍රියාවලිය තථ්‍ය කාලය තුළ නිරීක්ෂණය කිරීම සහ අවසාන වශයෙන් අච්චුව ප්‍රමාණාත්මකව විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා සම්මත වක්‍රය භාවිතා කිරීම.බහුලව භාවිතා වන qPCR ක්‍රම අතර SYBR Green I සහ TaqMan ඇතුළත් වේ.

4. කැදලි PCR

Nested PCR යනු PCR වර්ධක වට දෙකක් සඳහා PCR ප්‍රයිමර් කට්ටල දෙකක් භාවිතා කිරීම වන අතර දෙවන වටයේ විස්තාරණ නිෂ්පාදනය ඉලක්කගත ජාන ඛණ්ඩනය වේ.

පළමු ප්‍රයිමර් යුගලයේ නොගැලපීම (පිටත ප්‍රයිමර්) විශේෂිත නොවන නිෂ්පාදනයක් විස්තාරණය කිරීමට හේතු වේ නම්, එම විශේෂිත නොවන කලාපයම දෙවන ප්‍රයිමර් යුගලය විසින් හඳුනාගෙන අඛණ්ඩව විස්තාරණය කිරීමේ හැකියාව ඉතා කුඩා වේ, එබැවින් දෙවන ප්‍රයිමර් යුගල මගින් විස්තාරණය කිරීම, PCR හි විශේෂත්වය වැඩි දියුණු කර ඇත.PCR වට දෙකක් සිදු කිරීමේ එක් වාසියක් නම්, සීමිත ආරම්භක DNA වලින් ප්‍රමාණවත් නිෂ්පාදනයක් විස්තාරණය කිරීමට එය උපකාරී වීමයි.

5. Touchdown PCR

Touchdown PCR යනු PCR චක්‍ර පරාමිතීන් සකස් කිරීමෙන් PCR ප්‍රතික්‍රියාවේ විශේෂත්වය වැඩි දියුණු කිරීමේ ක්‍රමයකි.

ස්පර්ශක PCR වලදී, පළමු චක්‍ර කිහිපය සඳහා උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය ප්‍රයිමර්වල උපරිම නිර්වින්දන උෂ්ණත්වයට (Tm) අංශක කිහිපයක් ඉහළින් පිහිටුවා ඇත.ඉහළ නිර්වචන උෂ්ණත්වය ඵලදායි ලෙස නිශ්චිත නොවන විස්තාරණය අඩු කළ හැකිය, නමුත් ඒ සමඟම, ඉහළ ඇනීලිං උෂ්ණත්වය ප්‍රාථමික සහ ඉලක්ක අනුපිළිවෙලවල් වෙන් කිරීම උග්‍ර කරයි, ප්‍රතිඵලයක් ලෙස PCR අස්වැන්න අඩු වේ.එබැවින්, පළමු චක්‍ර කිහිපය තුළ, පද්ධතියේ ඉලක්කගත ජානයේ අන්තර්ගතය වැඩි කිරීම සඳහා සාමාන්‍යයෙන් එක් චක්‍රයකට 1 ° C කින් අඩු කිරීමට නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය සකසා ඇත.උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය ප්රශස්ථ උෂ්ණත්වයට පහත හෙලන විට, ඉතිරි චක්ර සඳහා නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය පවත්වා ගෙන යනු ලැබේ.

6. සෘජු PCR

සෘජු PCR යනු න්‍යෂ්ටික අම්ල හුදකලා කිරීම සහ පිරිසිදු කිරීමකින් තොරව නියැදියෙන් සෘජුවම ඉලක්කගත DNA වර්ධනය කිරීමයි.

සෘජු PCR වර්ග දෙකක් තිබේ:

සෘජු ක්‍රමය: නියැදි කුඩා ප්‍රමාණයක් ගෙන PCR හඳුනාගැනීම සඳහා PCR Master Mix වෙත කෙලින්ම එක් කරන්න;

ක්‍රැකින් ක්‍රමය: නියැදිය නියැදීමෙන් පසුව, එය ලයිසේට් වෙත එකතු කරන්න, ජෙනෝමය මුදා හැරීමට ලයිස් කරන්න, ලයිස්ඩ් සුපර්නැටන්ට් කුඩා ප්‍රමාණයක් ගෙන එය PCR මාස්ටර් මිශ්‍රණයට එකතු කරන්න, PCR හඳුනාගැනීම සිදු කරන්න.මෙම ප්‍රවේශය පර්යේෂණාත්මක කාර්ය ප්‍රවාහය සරල කරයි, ප්‍රායෝගික කාලය අඩු කරයි, සහ පිරිසිදු කිරීමේ පියවර වලදී DNA අලාභය වළක්වයි.

7. SOE PCR

අතිච්ඡාදනය වන දිගු PCR (SOE PCR) මගින් ජාන බෙදීම PCR නිෂ්පාදන අතිච්ඡාදනය වන දාම සෑදීම සඳහා අනුපූරක කෙළවර සහිත ප්‍රාථමිකයන් භාවිතා කරයි, එවිට වර්ධක ප්‍රතික්‍රියාවේදී, අතිච්ඡාදනය වන දාමවල දිගුව හරහා, විස්තාරණය කරන ලද කොටස් අතිච්ඡාදනය වන තාක්ෂණයේ විවිධ ප්‍රභවයන්. සහ එකට බෙදී ඇත.මෙම තාක්ෂණය දැනට ප්රධාන යෙදුම් දිශාවන් දෙකක් ඇත: විලයන ජාන ගොඩනැගීම;ජාන අඩවියට යොමු කරන ලද විකෘතිය.

8. IPCR

ප්‍රතිලෝම PCR (IPCR) ප්‍රයිමර් දෙක හැර අනෙකුත් DNA කොටස් විස්තාරණය කිරීමට ප්‍රතිලෝම අනුපූරක ප්‍රයිමර් භාවිතා කරන අතර දන්නා DNA කැබැල්ලක දෙපස නොදන්නා අනුපිළිවෙලවල් විස්තාරණය කරයි.

IPCR මුලින් නිර්මාණය කර ඇත්තේ යාබද නොදන්නා කලාපවල අනුපිළිවෙල තීරණය කිරීම සඳහා වන අතර, ජාන ප්‍රවර්ධක අනුපිළිවෙලවල් අධ්‍යයනය කිරීමට බොහෝ දුරට භාවිතා වේ;ජාන විලයනය, සංක්‍රමණය සහ සංක්‍රමණය වැනි ඔන්කොජනික් වර්ණදේහ ප්‍රතිසංවිධානය;සහ වෛරස් ජාන අනුකලනය, ද දැන් බහුලව භාවිතා වේ වෙබ් අඩවියට යොමු කරන ලද විකෘතිය සඳහා, අපේක්ෂිත විකෘතිය සහිත ප්ලාස්මිඩයක් පිටපත් කරන්න.

9. dPCR

සංඛ්‍යාංක PCR (dPCR) යනු න්‍යෂ්ටික අම්ල අණු නිරපේක්ෂ ප්‍රමාණනය කිරීමේ තාක්ෂණයකි.

න්‍යෂ්ටික අම්ල අණු ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා දැනට ක්‍රම තුනක් ඇත.ප්‍රභාමිතිය න්‍යෂ්ටික අම්ල අණු අවශෝෂණය කිරීම මත පදනම් වේ;තත්‍ය කාලීන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රමාණාත්මක PCR (Real Time PCR) Ct අගය මත පදනම් වන අතර Ct අගය මගින් අනාවරණය කර ගත හැකි ප්‍රතිදීප්ත අගයට අනුරූප වන චක්‍ර අංකයට යොමු වේ;ඩිජිටල් PCR යනු න්‍යෂ්ටික අම්ල ප්‍රමාණනය ගණනය කිරීම සඳහා තනි අණු PCR ක්‍රමය මත පදනම් වූ නවතම ප්‍රමාණාත්මක තාක්‍ෂණයකි.